2009年10月14日消息 - Hlicos  BioSciences（第三代测序仪制造商）的研究人员近日发表了一篇原理验证研究，说明利用其单分子测序技术来进行RNA直接测序的可行性，文章发表在9月23日的《Nature》在线版上。

    该研究小组利用一台Helicos样机，直接对酿酒酵母的RNA进行测序，而没有将其转变成cDNA。在这个过程中，他们还发现了许多酿酒酵母转录本3’端的异质性，同时有证据表明酵母中至少有一些核仁RNA和核糖体RNA是聚腺苷酸化的。

    随着RNA的重要性逐渐被人所认识，研究人员也开发出多种方法来研究它。但是，许多方法仍需将RNA反转录成cDNA，而这一步会引入错误，且效率不高。研究人员写道：“人们急需一种方法，而这种方法不会有反转录、扩增、连接以及其他cDNA合成步骤的相关困难，而是能利用极少量的总RNA来综合、无偏见地浏览转录组。”

    为了让“边合成边测序”的反应适应直接的RNA测序，Milos（Helicos的首席科学家）及她的同事优化了一切，从使用的聚合酶到缓冲液再到专利的荧光核苷酸类似物。总的来说，这种方法在poly(dT)包被的表面捕获聚腺苷酸化的RNA，并利用大肠杆菌poly(A)聚合酶I来进行边合成边测序的步骤。

    该小组首先对一段40个碱基的RNA序列进行测序，来检验这种方法。大约一半（48.5%）的读长是20个核苷酸或更长。最长的无误差读数是38个碱基。

    随后她们将注意力转向酿酒酵母这种模式生物。因为酿酒酵母的大部分RNA本身就存在聚腺苷酸化，所以她们不需要在测序前再加上poly-A尾巴。

    在这个实验中，研究小组产生了41261个读数，每个约为20个核苷酸或更长。近一半（48.4%）的读数与酵母genomics/">基因组配对。90%以上的配对读数是位于已知的酵母开放读码框3’端的400个核苷酸内。

    实验过程中，研究人员意外地检测到酵母RNA  3’端的异质性。她们还发现证据，暗示至少有一些酵母核糖体RNA和小核仁RNA（snoRNA）是聚腺苷酸化的。

    研究人员称这种RNA直接测序方法目前的错误率约为4%，大部分是黑暗碱基（dark  base）引起的缺失。插入的错误率为1-2%，而替换的概率只有0.1-0.3%。

    Milos介绍说，她们还在进行相似的研究，为哺乳动物细胞的直接RNA测序开发方法。她补充道，尽管实验是在Helicos样机上完成的，但该公司正在开发Heliscope的直接RNA测序步骤。该步骤有望在明年推出。

    上个月，Helicos的创始人之一Stephen  Quake在两名研究人员的协助下，利用一台Heliscope测序仪和4次数据收集运行，对他本人的基因组进行了测序。